درک جدید از CRISPR-Cas9 ابزار می تواند به بهبود ژن ویرایش

3D ساختار پایه ویرایشگر متشکل از پروتئین Cas9 (سفید و خاکستری) که متصل به DNA هدف (فیروزه ای و آبی مارپیچ) مکمل RNA راهنما (بنفش) و دآميناز پروتئین ها (قرمز و صورتی) که تغییر یک نوکلئوتید دیگر. (UC برکلی گرافیک توسط گاوین Knott و Audrone Lapinaite)

در صرف هشت سال CRISPR-Cas9 تبدیل شده است رفتن به ژنوم ویرایشگر برای هر دو پژوهش های بنیادی و ژن درمانی. اما CRISPR-Cas9 نیز باعث شده است دیگر به طور بالقوه قدرتمند DNA دستکاری ابزار است که می تواند کمک به رفع جهش های ژنتیکی مسئول بیماری های ارثی.

محققان در دانشگاه کالیفرنیا در برکلی در حال حاضر به دست آمده 3D ساختار یکی از مهمترین این ابزار: پایگاه ویراستاران که با اتصال به DNA و به جای برش دقیقا جای یک نوکلئوتید با یکی دیگر از.

برای اولین بار ایجاد چهار سال پیش, پایه, ویراستاران در حال حاضر در حال استفاده در تلاش برای اصلاح تک-نوکلئوتید جهش در ژنوم انسان. پایگاه سردبیران حاضر در دسترس است می تواند نشانی حدود 60 درصد از همه شناخته شده بیماری های ژنتیکی – به طور بالقوه بیش از 15000 به ارث برده اختلالات ناشی از یک جهش تنها در یک نوکلئوتید.

دقیق 3D ساختار گزارش شده در جولای 31 شماره از مجله علمفراهم می کند یک نقشه راه برای افزایش سرعت پایه سردبیران آنها را متنوع تر و قابل کنترل برای استفاده در بیماران است.

"ما قادر به مشاهده برای اولین بار یک پایه ویرایشگر در عمل" گفت: UC برکلی همکار فوق دکترا گاوین Knott. "در حال حاضر ما می توانیم درک نیست و تنها زمانی که کار می کند و زمانی که آن را نمی کند اما همچنین طراحی نسل بعدی پایه سردبیران آنها را حتی بهتر و بیشتر بالینی مناسب است."

یک پایه ویرایشگر نوع Cas9 فیوژن پروتئین است که در استخدام یک تا حدی غیر فعال Cas9 — آن برش قیچی غیر فعال هستند به طوری که این کاهش تنها یک رشته از DNA و آنزیم است که برای مثال فعال یا سکوت یک ژن و یا تغییر مناطق مجاور از DNA است. از آنجا که گزارش مطالعه جدید برای اولین بار ساختار Cas9 فیوژن پروتئین, آن می تواند کمک راهنمای اختراع بی شمار دیگر Cas9 مبتنی بر ژن-ابزار ویرایش.

"ما در واقع برای اولین بار است که پایه سردبیران رفتار به عنوان دو ماژول مستقل: شما باید Cas9 ماژول که به شما می دهد ویژگی و سپس شما باید یک کاتالیزوری ماژول است که شما فراهم می کند با فعالیت" گفت: Audrone Lapinaite سابق دانشگاه برکلی همکار فوق دکترا که در حال حاضر دستیار استاد در دانشگاه ایالتی آریزونا در تمپه. "ساختار ما رو از این پایه ویرایشگر محدود به هدف خود را واقعا به ما راه را به فکر می کنم در مورد Cas9 فیوژن پروتئین ها به طور کلی به ما ایده های کدام منطقه از Cas9 است که بیشتر مفید برای ترکیب پروتئین های دیگر."

Lapinaite و Knott که به تازگی پذیرفته شده و موقعیت به عنوان همکار تحقیقاتی در دانشگاه موناش در استرالیا در حال co-اولین نویسندگان این مقاله است.

"این ساختار به ما کمک می کند تا درک پایه ویراستاران در یک سطح بسیار عمیق تر گفت:" نویسنده ارشد جنیفر Doudna UC برکلی و استاد مولکولی و زیست شناسی سلولی و شیمی و Howard Hughes Medical Institute محقق شده است. "در حال حاضر که ما می توانید ببینید چه ما در حال کار با ما می تواند به توسعه آگاهانه استراتژی برای بهبود سیستم."

ویرایش یک پایه در یک زمان

در سال 2012 محققان برای اولین بار نشان داد که چگونه به reengineer یک باکتری آنزیم Cas9 و تبدیل آن به یک ژن-ابزار ویرایش در تمام انواع سلول ها از باکتری به انسان است. زاییده افکار از Doudna و فرانسوی همکار امانوئل Charpentier, CRISPR-Cas9 تبدیل کرده است تحقیقات بیولوژیکی آورده و ژن درمانی به کلینیک برای اولین بار در دهه.

3D ساختار پایه ویرایشگر آن را به عنوان ویرایشهای کشش DNA. (UC برکلی گرافیک توسط گاوین Knott)

دانشمندان سرعت شرکت تصمیم گرفتند Cas9 برای تولید کشت و ابزارهای دیگر. اساسا یک mash-up از پروتئین و RNA Cas9 دقیقا اهداف خاص کشش DNA و سپس دقیقا قیچی آن را مانند یک جفت قیچی. قیچی تابع می تواند شکسته شود اما اجازه می دهد Cas9 به هدف قرار دادن و اتصال DNA بدون برش. در این راه Cas9 می توانید کشتی های مختلف آنزیم به هدفمند مناطق DNA اجازه می دهد که آنزیم به دستکاری ژن.

در سال 2016 دیوید لیو از دانشگاه هاروارد و موسسه گسترده از موسسه تکنولوژی ماساچوست و دانشگاه هاروارد در ترکیب Cas9 با دیگر باکتری پروتئین اجازه می دهد تا با یک جراحی دقیق جایگزینی یک نوکلئوتید با: اولین پایگاه ویرایشگر.

در حالی که اوایل adenine پایه ویرایشگر آهسته بود, جدیدترین نسخه, به نام ABE8e است blindingly سریع: آن را کامل نزدیک به 100 درصد در نظر گرفته شده پایه ویرایش در 15 دقیقه. هنوز ABE8e ممکن است بیشتر مستعد ابتلا به ویرایش ناخواسته قطعه از DNA در یک لوله آزمایش به طور بالقوه ایجاد آنچه شناخته شده به عنوان هدف اثر است.

به تازگی نشان داد ساختار به دست آمده با طراحی تکنیک تصویربرداری به نام ابررساناها-ميکروسکوپ الکترونی (cryoEM). فعالیت سنجش نشان داد چرا ABE8e مستعد ابتلا به ایجاد کردن-هدف ویرایش: این دآميناز پروتئین ذوب شده به Cas9 همیشه فعال است. به عنوان Cas9 رازک در اطراف هسته آن متصل می شود و انتشار صدها یا هزاران نفر از بخش DNA قبل از آن را می یابد و آن هدف در نظر گرفته. متصل دآميناز مانند یک توپ سست نمی کند منتظر یک بازی کامل و اغلب ویرایشهای پایه قبل از Cas9 می آید و به استراحت در آن هدف نهایی.

دانستن چگونه موثر دامنه و Cas9 مرتبط هستند می تواند منجر به یک طراحی مجدد است که باعث می شود آنزیم های فعال تنها زمانی که Cas9 پیدا کرده است هدف خود را.

"اگر شما واقعا می خواهید به طراحی واقعا خاص فیوژن پروتئین شما باید برای پیدا کردن یک راه را به ناحيه کاتاليتيک بیشتر بخشی از Cas9 به طوری که آن را احساس زمانی که Cas9 است در صحیح هدف و سپس فعال کنید به جای فعال بودن در همه زمان ها" Lapinaite گفت.

ساختار ABE8e نیز مشخص می کند دو تغییرات خاص در دآميناز پروتئین است که آن را به کار سریع تر از نسخه اولیه پایگاه ویرایشگر ABE7.10. این دو نقطه جهش اجازه می دهد که پروتئین برای گرفتن DNA تنگ تر و کارآمد تر جایگزین با G.

"به عنوان یک ساختاری زیست شناس, من واقعا می خواهید به نگاه در یک مولکول و فکر می کنم در مورد راه های عقلانی آن را بهبود بخشد. این ساختار و همراه بیوشیمی واقعا به ما که قدرت" Knott اضافه شده است. "ما هم اکنون می توانید منطقی predications برای این سیستم چگونه رفتار خواهد شد در یک سلول از آنجا که ما می توانید آن را ببینید و پیش بینی آن را برای رفتن به شکستن و یا پیش بینی راه هایی برای آن را بهتر است."

"در حالی که پایه ویراستاران در حال حاضر به طور گسترده ای استفاده می شود به معرفی دقیق تغییرات در موجودات زنده اعم از باکتری ها به گیاهان و پستانداران و هیچ کس قبلا مشاهده سه بعدی ساختار مولکولی پایه ویرایشگر گفت:" لیو که همچنین یک Howard Hughes Medical Institute محقق شده است. "این پروژه مشترک نشان می دهد زیبا مولکولی ساختار دولت از-هنر بسیار فعال پایه editor — ABE8e — در عمل درگیر یک هدف DNA سایت."

در علاوه بر این به Lapinaite, Knott, Doudna و لیو دیگر کاغذ co-نویسنده کودی Palumbo و پیتر Beal از UC Davis, انریکه لین-Shiao از دانشگاه برکلی و میشل ریشتر و کوین ژائو موسسه گسترده همکاری بین دانشگاه هاروارد و موسسه تکنولوژی ماساچوست.

اطلاعات مربوط به